Novinky - Monitorování hladin rozpuštěného kyslíku v procesu biofarmaceutické fermentace

Co je rozpuštěný kyslík?

Rozpuštěný kyslík (DO) označuje molekulární kyslík (O_₂), který je rozpuštěn ve vodě. Liší se od atomů kyslíku přítomných v molekulách vody (H_₂O), protože se ve vodě nachází ve formě nezávislých molekul kyslíku, buď pocházejících z atmosféry, nebo generovaných fotosyntézou vodních rostlin. Koncentrace rozpuštěného kyslíku je ovlivněna různými faktory, včetně teploty, slanosti, průtoku vody a biologické aktivity. Jako takový slouží jako kritický ukazatel pro posouzení zdravotního stavu a stavu znečištění vodního prostředí.

Rozpuštěný kyslík hraje zásadní roli v podpoře mikrobiálního metabolismu, ovlivňuje buněčné dýchání, růst a biosyntézu metabolických produktů. Vyšší hladiny rozpuštěného kyslíku však nejsou vždy prospěšné. Nadbytek kyslíku může vést k dalšímu metabolismu nahromaděných produktů a potenciálně způsobit toxické reakce. Optimální hladiny rozpuštěného kyslíku (DO) se u různých bakteriálních druhů liší. Například během biosyntézy penicilinu se DO obvykle udržuje na přibližně 30% nasycení vzduchem. Pokud DO klesne na nulu a zůstane na této úrovni po dobu pěti minut, může být tvorba produktů výrazně narušena. Pokud tento stav přetrvává po dobu 20 minut, může dojít k nevratnému poškození.

V současné době nejčastěji používané senzory rozpuštěného kyslíku (DO) dokáží měřit pouze relativní saturaci vzduchu, nikoli absolutní koncentraci rozpuštěného kyslíku. Po sterilizaci kultivačního média se provádí provzdušňování a míchání, dokud se hodnota senzoru nestabilizuje, načež se hodnota nastaví na 100% saturaci vzduchem. Následná měření během fermentačního procesu jsou založena na této referenci. Absolutní hodnoty DO nelze stanovit pomocí standardních senzorů a vyžadují pokročilejší techniky, jako je polarografie. Měření saturace vzduchu je však obecně dostatečné pro monitorování a řízení fermentačních procesů.

V rámci fermentoru se hladiny rozpuštěného kyslíku (DO) mohou v různých oblastech lišit. I když je v jednom bodě dosaženo stabilní hodnoty, v určitých kultivačních médiích se mohou stále vyskytovat výkyvy. Větší fermentory mají tendenci vykazovat větší prostorové variace v hladinách rozpuštěného kyslíku, což může významně ovlivnit mikrobiální růst a produktivitu. Experimentální důkazy ukázaly, že ačkoli průměrná hladina rozpuštěného kyslíku může být 30 %, fermentační výkon za kolísavých podmínek je výrazně nižší než za stabilních podmínek. Proto při zvětšování kapacity fermentorů – kromě zohlednění geometrické a výkonové podobnosti – zůstává minimalizace prostorových variací DO klíčovým cílem výzkumu.

Proč je monitorování rozpuštěného kyslíku nezbytné při biofarmaceutické fermentaci?

1. Udržovat optimální růstové prostředí pro mikroorganismy nebo buňky
Průmyslová fermentace obvykle zahrnuje aerobní mikroorganismy, jako je Escherichia coli a kvasinky, nebo savčí buňky, jako jsou buňky vaječníků čínského křečka (CHO). Tyto buňky fungují jako „pracovnice“ ve fermentačním systému a pro dýchání a metabolickou aktivitu vyžadují kyslík. Kyslík slouží jako terminální akceptor elektronů v aerobním dýchání, což umožňuje produkci energie ve formě ATP. Nedostatečný přísun kyslíku může vést k buněčnému udušení, zastavení růstu nebo dokonce k buněčné smrti, což nakonec vede k selhání fermentace. Monitorování hladin rozpuštěného kyslíku zajišťuje, že koncentrace kyslíku zůstávají v optimálním rozmezí pro trvalý růst a životaschopnost buněk.

2. Zajistit efektivní syntézu cílových produktů
Cílem biofarmaceutické fermentace není pouze podpora buněčné proliferace, ale usnadnění efektivní syntézy požadovaných cílových produktů, jako je inzulín, monoklonální protilátky, vakcíny a enzymy. Tyto biosyntetické dráhy často vyžadují značný energetický vstup, primárně pocházející z aerobního dýchání. Kromě toho mnoho enzymatických systémů zapojených do syntézy produktů přímo závisí na kyslíku. Nedostatek kyslíku může narušit nebo snížit účinnost těchto drah.

Hladiny rozpuštěného kyslíku (DO) navíc fungují jako regulační signál. Jak nadměrně vysoké, tak i nízké koncentrace DO mohou:
- Mění buněčné metabolické dráhy, například přechodem z aerobního dýchání na méně efektivní anaerobní fermentaci.
- Spouštějí buněčné stresové reakce, což vede k produkci nežádoucích vedlejších produktů.
- Ovlivňují hladiny exprese exogenních proteinů.

Přesnou regulací hladin rozpuštěného kyslíku v různých fázích fermentace je možné řídit buněčný metabolismus směrem k maximální syntéze cílového produktu, a tím dosáhnout fermentace s vysokou hustotou a vysokým výtěžkem.

Úvod do diagramu toku vody pro biofarmaceutické výrobky

3. Aby se zabránilo nedostatku nebo nadbytku kyslíku
Nedostatek kyslíku (hypoxie) může mít závažné následky:
- Růst buněk a syntéza produktů se zastaví.
- Metabolismus se přesouvá k anaerobním drahám, což vede k akumulaci organických kyselin, jako je kyselina mléčná a kyselina octová, které snižují pH kultivačního média a mohou otrávit buňky.
- Dlouhodobá hypoxie může způsobit nevratné poškození, přičemž zotavení je neúplné i po obnovení přísunu kyslíku.

Nadbytek kyslíku (přesycení) také představuje rizika:
- Může vyvolat oxidační stres a tvorbu reaktivních forem kyslíku (ROS), které poškozují buněčné membrány a biomolekuly.
- Nadměrné provzdušňování a míchání zvyšuje spotřebu energie a provozní náklady, což vede k zbytečnému plýtvání zdroji.

4. Jako kritický parametr pro monitorování v reálném čase a zpětnovazební řízení

Rozpuštěný kyslík (DO) je parametr v reálném čase, který je kontinuální a komplexní a odráží vnitřní podmínky fermentačního systému. Změny hladin DO mohou citlivě indikovat různé fyziologické a provozní stavy:
- Rychlý růst buněk zvyšuje spotřebu kyslíku, což způsobuje pokles hladiny rozpuštěného kyslíku.
- Vyčerpání nebo inhibice substrátu zpomaluje metabolismus, snižuje spotřebu kyslíku a způsobuje zvýšení hladiny rozpuštěného kyslíku.
- Kontaminace cizími mikroorganismy mění vzorec spotřeby kyslíku, což vede k abnormálním výkyvům rozpuštěného kyslíku a slouží jako včasný varovný signál.
- Poruchy zařízení, jako je selhání míchadla, ucpání ventilačního potrubí nebo znečištění filtru, mohou také vést k abnormálnímu chování rozpuštěného kyslíku.

Integrací monitorování rozpuštěného kyslíku v reálném čase do automatizovaného systému zpětnovazebního řízení lze dosáhnout přesné regulace úrovní rozpuštěného kyslíku dynamickým nastavením následujících parametrů:
- Rychlost míchání: Zvýšení rychlosti zlepšuje kontakt plynu s kapalinou rozbitím bublin, čímž se zlepšuje účinnost přenosu kyslíku. Toto je nejčastěji používaná a nejúčinnější metoda.
- Rychlost provzdušňování: Úprava průtoku nebo složení vstupního plynu (např. zvýšení podílu vzduchu nebo čistého kyslíku).
- Tlak v lahvi: Zvýšení tlaku zvyšuje parciální tlak kyslíku, a tím zvyšuje rozpustnost.
- Teplota: Snížení teploty zvyšuje rozpustnost kyslíku v kultivačním médiu.

Doporučení produktů BOQU pro online monitorování biologické fermentace: